HiCAM Fluo高速荧光成像相机在微流控研究中的应用

Lambert Instruments公司推出的HiCAM Fluo是一款专为高速荧光成像、弱光成像相机设计的高性能科学相机。荧光寿命成像相机成功解决了在微流控、生物物理、化学动力学等领域中，对低发光强度过程进行高速捕捉的极端技术挑战。本技术文档基于马克斯·普朗克研究所（Max Planck Institute）的一项前沿研究案例，详细阐述HiCAM Fluo在微流控液滴功能化研究中的具体应用、技术原理与卓越性能。

应用背景与技术挑战

-研究背景（微流控研究）：

马克斯·普朗克研究所的Jahnke, Weiss, Frey等研究人员于2019年发表了一项创新研究，旨在开发一种通过胆固醇标记DNA在液滴外围自组装来实现微流控液滴功能化的新方法。该研究的核心是观察胆固醇标记DNA与液滴外围的动力学相互作用，这需要对液滴生成过程进行高速视频记录。

图1：油中水滴的示意图。红色虚线左侧，水滴已被胆固醇标记的DNA进行功能化修饰;虚线右侧则添加了不含胆固醇的DNA，但水滴并未被进一步功能化。

-核心挑战：

该微流控研究实验面临两个相互叠加的极端挑战，对成像设备提出了苛刻要求：

高速要求：单个水包油液滴的生成时间极短，小于0.003秒。为了捕捉单个液滴形成的完整序列，需要极高的帧率。若希望获得至少10帧图像来描绘一个液滴的生成过程，则相机的帧率必须不低于3334 fps。

低光强度：实验检测的光信号来源于Cy3荧光染料。荧光信号的发光强度通常非常微弱，因此需要一台具有极高灵敏度的相机。这种灵敏度需求通常通过图像增强器来实现。

将高帧率与高灵敏度结合，构成了对传统成像设备的巨大挑战。常规高速相机难以在如此高的帧率下捕捉微弱的荧光信号，而高灵敏度相机又往往无法达到所需的高速性能。

成像系统与配置

核心设备：荷兰LAMBERT HiCAM Fluo

图2：成像系统包括一台HiCAM荧光弱光成像相机(绿色)、显微镜和PC计算机。

HiCAM Fluo是一款集成了高速CMOS传感器与单级双微通道板（MCP）图像增强器的专用高速荧光成像相机。其设计初衷正是为了克服上述高速与弱光无法兼得的矛盾。

实验成像设置

研究中的成像系统搭建如下：

相机耦合：HiCAM Fluo通过镜头轻松耦合到显微镜的相机端口，其输入镜头卡口的后焦距离已预设好，便于集成。

数据连接：荧光成像相机通过CoaXPress接口连接到计算机内的帧捕获器，支持高达25 Gbps的直接数据流传输到硬盘，满足高速连续记录的需求。

荧光激发与滤光：使用荧光照明器（HBO 100, Carl Zeiss AG）和FS43HE滤光片（Carl Zeiss AG）来激发和收集Cy3标记DNA（λ = 550 nm）的荧光信号。

物镜：使用40倍物镜（LD Plan-Neofluar 40x/0.6 Korr, Carl Zeiss AG）对液滴进行放大成像。

光电阴极选择：根据Cy3染料的最大发射波长（550 nm），选择了GaAsP光电阴极，因为该阴极在此波长附近具有最高的量子效率，确保了信号转换的最佳灵敏度。

荧光成像相机、高速成像相机微流控实验方法

微流控芯片

实验使用基于PDMS的微流控器件生成DNA功能化的、表面活性剂稳定的水包油液滴。该器件包含一个油相入口和一个水相入口。水相入口含有10 µM的Cy3标记的胆固醇标记DNA（或未标记胆固醇的对照DNA），流速为30 µL/h。油相入口含有商业表面活性剂，流速为120 µL/h。两相在流动聚焦交叉结处相遇，生成液滴。

图3：微流体PDMS基器件的示意图概览

相机参数设置

实验中使用三种相机参数捕获了三段视频：

-为捕捉单个液滴的生成，使用了4086 fps的帧率。为实现此高帧率，分辨率调整为640 x 480像素。

-使用1000 fps的帧率（相机在1280 x 1024全分辨率下也能达到此帧率），分辨率保持640 x 480像素。

-增强器设置：单级双MCP增强器的门宽设置为4 ms，MCP增益设置为1.1 kV，以提供捕获微弱荧光信号所需的高灵敏度。

结果与分析

液滴生成过程成像：

HiCAM Fluo成功在4086 fps的帧率下，记录了单个液滴在交叉结处形成的12帧连续图像序列。图像清晰显示，在液滴生成的瞬间，胆固醇标记的DNA已均匀分布在整个液滴内部（图像呈现均匀的白色），证明功能化过程在生成时即已发生。

图4：12张图像中的一系列最后8张图像

液滴外围功能化验证

图5（含胆固醇标记DNA）：出口处的液滴图像显示，白色圆圈的边缘亮度明显高于中心。这表明Cy3标记的胆固醇标记DNA在液滴外围的浓度增加，成功实现了在液滴外围的特异性功能化。

图5：输出端的液滴，含有Cy3标记的胆固醇标记DNA。外围区域的DNA浓度增加。

图6（含胆固醇游离DNA）：作为对照，出口处的液滴图像呈现均匀的白色，表明DNA均匀分布在整个液滴内，无外围富集现象。

图6：输出端的液滴，含有Cy3标记的无胆固醇DNA。DNA均匀分布在液滴中。

通过对比图5和图6所在的视频，研究人员证实，DNA在液滴外围的富集过程发生在液滴从交叉结流到出口的短暂时间内。

HiCAM Fluo高速荧光成像相机与传统高速成像相机的对比

研究明确指出，使用传统高速相机无法完成此实验。原因在于，传统高速相机的传感器灵敏度不足以在如此高的帧率下检测低浓度荧光染料发出的微弱信号。若想用传统相机检测到信号，必须增加曝光时间，从而降低帧率，但这会导致无法捕捉液滴生成的高速动态过程。唯一的妥协方法是降低微流控设备的流速，但这改变了实验条件本身，而非克服了技术挑战。

结论

Lambert Instruments的HiCAM Fluo相机、荧光寿命成像相机在本案例中证明了其应对极端成像挑战的卓越能力。它通过集成高速CMOS相机与高性能单级双MCP图像增强器，独一无二地同时满足了高速成像超高帧率（>4000 fps） 与超低光信号检测的双重要求。

HiCAM Fluo荧光寿命成像相机的成功应用，使得研究人员能够在不改变样品状态或实验条件的前提下，直接观察和量化微流控系统中高速、弱光的荧光动力学过程，为微流控、单细胞分析、化学反应动力学等前沿领域的研究提供了强大的工具。其价值在于将原本“不可见”的高速微观过程转化为可定量分析的视觉数据，推动了相关科学的进步。

参考文献：Jahnke, K., Weiss, M., Frey, C., Antona, S., Janiesch, J., Platzman, I., Göpfrich, K., & Spatz, J.P. (2019). Programmable Functionalization ofSurfactant-Stabilized Microfluidic Droplets via DNA-Tags. Advanced Functional Materials, 29(23).