作者：叶gx 时间：2026-07-03
本文提出一种基于高分辨率夏克-哈特曼波前传感器的定量光程差显微镜（投射式成像设备）。利用波前重构技术，通过传感器采集的梯度场积分，可直接获得样品厚度与折射率引起的光程差。该非干涉技术可在空间非相干照明下工作，光能利用率高。作为通用光学元件，夏克-哈特曼波前传感器可通过下述原理，将普通显微镜改造为光程差成像设备。成像光路由物镜与镜筒透镜组成光学系统，将样品成像投影至夏克哈特曼微透镜（MLA）。波前传感光路由光源、光程差分布未知的透明样品、物镜、镜筒透镜、夏克-哈特曼微透镜阵列组成。
在普通非相干光学显微镜中，若照明光在样品平面的空间相干长度大于显微镜分辨率，夏克-哈特曼波前传感器可用于样品光程差的定量测量。实现该条件需满足：照明数值孔径小于成像透镜数值孔径。基于此原理，本文搭建了一种无参考、高分辨率的仪器，可表征微光学元件与显微生物样品的光程差。
1. 引言
光程差（OPD）是现代显微镜的重要成像模态，能提供显微样品结构的额外信息，尤其适用于样品吸收弱、光强调制不明显的场景。在微光学元件表征等领域，需测量样品光程差的定量分布，精度需达到常规光学检测水平。
相差显微镜可呈现样品光程差，实现方式多样。泽尔尼克相差显微镜通过调控散射光与直射光的相位差提升图像对比度，但光强信息无法直接换算为光程差，且图像存在固有晕圈与渐晕伪影。微分干涉相差显微镜属于剪切干涉技术，通过轻微偏移两束偏振光并使其干涉，生成相位梯度对比度，因伪三维成像效果好、横向分辨率高而应用广泛，但由于响应非线性，无法用于光程差定量测量。
干涉法（如干涉显微镜、数字全息显微镜）可实现高横向分辨率的定量相位测量，但需高相干光源；白光干涉法通常需高精度位移台才能完成定量测量。此外，这类干涉法依赖高相干参考光束，实际应用受限。
相位分集法利用成熟衍射理论迭代求解逆问题以恢复相位，但通常收敛慢、因问题病态导致解不唯一。通过增加冗余约束（如不同距离、相位、孔径下的光强测量）可优化相位恢复效果，但额外装置会增加成像系统复杂度。
波前传感技术在自适应光学领域已成熟应用。四波横向剪切干涉波前传感器可实现定量相位成像，灵敏度达纳米级；近期，分孔径波前传感技术采用四叶形透镜，也实现了非相干照明下的定量相位测量。
夏克-哈特曼（SH）波前传感器广泛用于检测光束平滑波前，低阶重构限制使其横向分辨率一度低于干涉传感器与相位恢复传感器。但高分辨率夏克-哈特曼传感器的发展，推动其直接应用于成像领域，例如已有研究实现基于夏克-哈特曼传感器的全息成像。
本文提出一种基于高分辨率夏克-哈特曼波前传感器的定量光程差显微镜。利用波前重构技术，通过传感器采集的梯度场积分，可直接获得样品厚度与折射率引起的光程差。该非干涉技术可在空间非相干照明下工作，光能利用率高。作为通用光学元件，夏克-哈特曼波前传感器可通过下述原理，将普通显微镜改造为光程差成像设备。
2. 工作原理
图1夏克-哈特曼定量光程差显微镜光路示意图
基于夏克-哈特曼传感器的光程差显微镜光路如图1所示，核心包含两条光路：
成像光路：由物镜与镜筒透镜组成光学系统，将样品成像投影至夏克-哈特曼微透镜阵列（MLA），放大倍率M=ft/fo（ft为镜筒透镜焦距，fo为物镜焦距）。该光路中，每个微透镜对应样品光强图像的一个像素。
波前传感光路：由光源、光程差分布未知的透明样品、物镜、镜筒透镜、夏克-哈特曼微透镜阵列组成。当光源距离样品L ≫ fo时，光源首次成像于物镜光瞳面，其位置随样品引入的波前倾斜量变化。包含光源像的光瞳面，经镜筒透镜与单个微透镜组成的系统，共轭至图像传感器。每个微透镜对应样品平面的一个分辨率点，因此微透镜后方光源像的横向偏移量，与样品对应位置引入的局部波前倾斜量相关。
为获得光斑位置与光程差梯度线性相关的标准夏克 - 哈特曼图案，需满足两个物理条件：
（1）样品散射光锥半角a小于物镜孔径角，保证散射光在物镜光瞳内有足够传播空间：
tan(a) ≪ Ao（Ao为物镜数值孔径）
（2）微透镜后方光源像尺寸小于微透镜阵列间距，保证光斑质心定位准确：
tan(a/M) ≪ AM（AM为微透镜阵列数值孔径）
假设样品对散射光锥影响较小，角度a主要由照明数值孔径As决定。根据范西泰特-泽尼克定理，数值孔径为As的扩展光源，在样品平面提供的相干尺寸约为λ/As；而显微镜分辨率由成像透镜数值孔径决定，约为λ/Ao。由此得出：夏克-哈特曼传感器正常工作的核心条件为，照明光在样品平面的空间相干长度大于显微镜光学分辨率。
在夏克哈特曼微透镜平面，当微透镜尺寸小于显微镜点扩散函数（PSF）时，可实现全空间分辨率；若微透镜尺寸大于点扩散函数，只要满足条件2，仍可实现波前重构，仅空间分辨率略有下降。
与自适应光学领域要求传感器全孔径完全相干不同，本方法仅需局部相干。原因在于：光程差是确定性函数，本身具有相干性，仅需探测光局部相干即可表征；而自适应光学中，波前需全传感器孔径（含所有微透镜）相干，才能确定其确定性函数。
显微镜放大倍率M会使微透镜阵列平面的波前梯度缩小M倍，波前幅值保持不变。假设光斑呈圆对称、光强均匀，采集的夏克-哈特曼图案可近似为受波前梯度∂W/∂x、∂W/∂y调制的规则焦斑阵列，光强分布为：
（F为微透镜焦距，P为微透镜阵列间距）
光源需满足光斑对称假设条件。样品弱吸收不影响光斑偏移；强吸收时，需调整曝光参数或采用高动态范围技术优化夏克-哈特曼图案。本文采用傅里叶解调法提取波前梯度：无样品时采集参考波前校准传感器；测量样品时，通过与参考波前对比，得到样品引入的光程差梯度∂O(x,y)/∂x、∂O(x,y)/ ∂y；最后通过二维梯度积分重构光程差：
（F、F-1分别为傅里叶变换与逆傅里叶变换，fx、fy为频域坐标）
若波前梯度存在相位跳变，需进行相位解包处理。
3. 实验验证与结果
3.1 微透镜阵列样品测量
为验证方法可行性与精度，搭建图1所示定制显微镜，测量夏克哈特曼微透镜（APO-Q-P300-R8.6，德国AMUS公司）的光程差分布。
光源：准直LED（中心波长460 nm，带宽25 nm，数值孔径As≈0.02）
夏克-哈特曼传感器：商用传感器（FS3370-O-P63-F2，俄罗斯OKO Tech公司），含140×140个微透镜，间距63μm，焦距2mm，搭配2048×2048 CMOS图像传感器
显微镜配置：10×物镜（Ao=0.25）+ 400 mm镜筒透镜（额外放大2.5倍），总放大倍率25×，满足条件：P≤M*λ/A0
实验结果
图 2 微透镜阵列测量结果
(a) 10×物镜明场像；(b) LED照明下三维光程差图；(c) 微透镜厚度图；(d) LED与激光照明下中心截面曲线
样品规格：平凸球形微透镜，间距300μm，标称焦距18.6mm，矢高1.31μm
图 2 (a)：明场像对比度极低，仅可见环形结构
图 2 (b)：LED照明下重构的三维光程差图，清晰呈现光刻工艺形成的层状结构
图 2 (c)：单微透镜光程差换算后的光学厚度图（熔融石英折射率n=1.4647，460 nm）
图 2 (d)：微透镜厚度中心截面曲线：LED测量矢高 1.388 μm，与标称值吻合；635 nm 激光测量（折射率n=1.4570）结果与LED高度一致，差异源于激光散斑噪声
空间分辨率：rs=P/M≈2.5um；无噪声条件下，单微透镜光程差误差约0.34 nm，与厂商独立检测数据完全一致。
3.2 照明相干性影响分析
通过毛玻璃（直径25.4 mm）调控光源角尺寸As=D/2L（L为毛玻璃与样品距离），研究照明相干性对测量精度的影响。
结果（图 3）：
As≤0.17时，光程差重构准确；
As接近Ao(0.25)时，测量误差快速增大；
As>Ao时，光源像尺寸超过物镜光瞳，光斑偏移信号消失。
图 3 微透镜矢高测量值随照明数值孔径As变化曲线
3.3 生物样品测量
3.3.1 红细胞样品采用40×物镜（NA=0.65）观察未染色干燥红细胞涂片：
图 4 (a)：明场像仅可见红细胞轮廓，内部细节因透明无法分辨；
图 4 (b)：夏克-哈特曼光斑图案；
图 4 (c)：重构光程差图，清晰呈现红细胞环形形貌，为血液疾病诊断提供潜在应用价值。
图 4 红细胞测量结果
(a) 明场像；(b) 夏克 - 哈特曼光斑图案；(c) 重构光程差图
3.3.2 活人口腔上皮细胞
图 5 活人口腔上皮细胞测量结果
样品置于生理盐水中，夹于载玻片与盖玻片之间：
图5：左为明场像，右为重构光程差图；
光程差图可清晰分辨细胞核、细胞质、细胞膜褶皱等结构，无需染色标记；
曝光时间<5ms，可实时监测细胞及亚细胞活动。
4. 结论
本文证实：夏克-哈特曼传感器用于透明样品光程差表征时，需满足照明光样品平面空间相干长度>显微镜分辨率、照明数值孔径<成像透镜数值孔径。该条件可兼顾显微镜高分辨率成像与光程差精准测量。
基于上述原理，搭建了简易、稳定的定量光程差显微镜，实现微光学元件与生物样品的高精度光程差表征。通过调整照明光路参数，可直接改造普通显微镜为光程差成像设备（投射式成像设备），实现低成本光程差定量分析。实验仅验证了投射式成像设备，该技术在反射式表面形貌成像领域同样具备应用潜力。
文章来源：H. Gong, T. E. Agbana, P. Pozzi, O. Soloviev, M. Verhaegen, and G. Vdovin, “Optical path difference microscopy with a Shack–Hartmann wavefront sensor,” Optics Letters, vol. 42, no. 11, pp. 2122–2125, Jun. 1, 2017, doi: 10.1364/OL.42.002122.
