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衍射激光分束器提高共聚焦显微镜的成像速度

作者: 时间:2022-04-12

共焦显微镜是一种将照明限制在面积小、衍射有限的光斑上的方法,从而提高分辨率。在经典的单点共聚焦显微镜中,一个亮点被聚焦在物体上,来自物体的散射光通过一个针孔,以阻断聚焦散射光。这会使物体产生非常清晰的光斑图像,通过扫描和集成,可以产生与标准光学显微镜相比具有更高分辨率的全视场图像。

不幸的是,这种扫描光斑的过程意味着在成像速度、视野大小和分辨率之间存在取舍。为了实现更快的成像,人们发明了更巧妙的照明方案,通常利用微光学元件,如衍射光学元件和微透镜阵列。随着激光功率的不断增加,有一种方法越来越受欢迎,那就是使用衍射激光分束器在物镜的整个视场上产生一个衍射有限的光斑阵列。然后,这个光斑阵列可以以类似于单点扫描共聚焦显微镜的方式进行成像,衍射激光分束器提高在共聚焦显微镜的成像速度,从而在整个视场上获得高分辨率,并且采集时间短。

在共聚焦激光扫描荧光显微镜上观察的生物样本

什么是衍射激光分束器?

衍射激光分束器简称分束器,是一个扁平、轻薄的光学元件,它从输入的激光束中产生一个光束阵列。阵列中的光束具有确定的、相等的分离角,当被物镜聚焦时,会产生一个具有预先确定的分离和排列的光斑矩阵。

对于矩阵中的每个分裂的激光束,激光束在工作面上的光斑大小与原始激光束的衍射限制光斑大小相同。因此,使用衍射式分束器时,分辨率不会降低。而使用透镜阵列的方法则会降低成像分辨率,因为子透镜的孔径衍射会增加激光束在焦平面的光斑直径。


激光分束器在显微镜中的典型应用案例

通常情况下,共聚焦显微镜使用放大率为X60-X100的湿浸式物镜。物镜上典型的激光束直径为~6毫米,由此产生的衍射限制光斑尺寸小于1微米。

视野通常大于100微米,需要50mrad或更大的分割角。使用Holo/Or的衍射式激光分束器很容易实现这些目标。

一个典型的大视野显微镜设置包括激光束入射到激光分束镜上,然后使用振镜和物镜进行偏转,或物镜的X-Y运动来扫描视野。这样就可以在整个物镜区域内扫描多个光点,将获得图像所需的时间减少到与光点数量相等的系数。为了在整个点阵上实现良好的性能和高信噪比,需要使用>100mw的相对高功率照明。因此,衍射式光学激光分束器必须由整体性的、高耐久性的材料(如熔融石英)制成。这对于基于紫外线的共聚焦显微镜等情况来说尤其如此,在这种情况下,聚合物和塑料光学器件大多是无用的。

另一种利用衍射激光分束镜的配置是类似于尼普科夫盘的升级设置。在这种设置中,类似于尼普科夫盘产生的光照模式是由一个衍射式光学激光分束器产生的。与笨重的Nipkow盘相比,这个元件可以更容易地旋转,同时仍然达到激光束的衍射有限的光斑直径。 通过旋转元件,通过物镜投射的图案就会旋转,从而实现对场内点的自动轴向扫描。


共焦显微镜的一些常见问题

共焦显微镜是如何工作的?

在共聚焦显微镜中,一个面积小、衍射有限的激光斑点照亮了图像领域的一个小区域,散射光被过滤以去除高角度。这个小点在像场上被扫描,与照亮整个像场相比,其结果是更清晰的图像。


什么是衍射激光分束器?

简称分束器,衍射激光分束器是一个薄而平的部件,它将激光束分成一个具有相同分离度的子光束矩阵。当聚焦时,这就形成了一个点的阵列。


在共聚焦显微镜中使用衍射激光分束器的优势是什么?

共聚焦显微镜中使用衍射激光分束器时,衍射激光分束器提高在共聚焦显微镜的成像速度,其通过产生一个衍射有限的光斑矩阵,使系统能够扫描更短的距离,因为多个独立的斑点同时被照亮。这大大减少了生成完整图像所需的时间。

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